A fibromialgia (FM) é uma das formas mais comuns de dor crónica generalizada, com uma prevalência estimada de 2-4% na população adulta. A FM é caracterizada por dor, cansaço, insónias e sintomas cognitivos. Como não existem critérios de diagnóstico objetivos além destes sintomas, a FM causa uma deterioração da qualidade de vida das pessoas. O aumento do conhecimento das interações entre a microbiota intestinal e o sistema nervoso central, também conhecido como “eixo entero-cerebral”, sugere que também pode afetar o processamento e perceção da dor. Para compreender melhor a fisiopatologia da FM, comparou-se a microbiota intestinal de 77 mulheres canadianas com FM (com 46 anos e diagnosticadas há 12 anos, em média) com a de 79 indivíduos de controlo (11 familiares em primeiro grau, 20 membros do agregado familiar e 48 sujeitos não relacionados) com base na análise de 16S rRNA e de todo o genoma.

Taxa associada à gravidade da FM

Não foi observada nenhuma diferença entre as doentes com FM e os indivíduos saudáveis, em termos de diversidade e estrutura geral da população microbiana. No entanto, um exame mais pormenorizado mostrou uma associação entre a abundância de vários taxa e a gravidade dos sintomas ligados à FM, incluindo dor intensa, dor localizada, cansaço, insónias e sintomas cognitivos.

Uma assinatura específica

A comparação entre doentes e indivíduos de controlo também revelou uma assinatura específica na microbiota fecal das doentes com FM: 19 espécies foram identificadas – algumas relativamente menos abundantes em doentes com FM, enquanto outras eram mais abundantes. Várias estão envolvidas no metabolismo do butirato e do propionato, dois ácidos gordos de cadeia curta. As concentrações séricas destes ácidos gordos estão alteradas em doentes com FM, que têm níveis elevados de butirato e baixos de propionato. Estes ácidos gordos podem estar envolvidos nos mecanismos que associam a disbiose aos sintomas observados. Finalmente, alguns taxa presentes em doentes com FM também são observados em outras síndromes disfuncionais – síndrome do intestino irritável, síndrome da fadiga crónica, cistite intersticial – enquanto outros parecem ser específicos de FM.

Um algoritmo de identificação?

Além de um melhor conhecimento da FM, ou até de potenciais aplicações terapêuticas, os investigadores abriram o caminho para um possível teste de diagnóstico para doentes com FM. Um algoritmo de machine learning (sidenote: Machine Learning Tecnologia de inteligência artificial devida à qual os computadores “aprendam”, somente pelo processamento de um vasto leque de dados. )  baseado apenas na composição da microbiota parece conseguir distinguir doentes com FM de indivíduos de controlo, com uma precisão de 87,8%.

A hepatite alcoólica é forma mais grave de doença hepática alcoólica : e está associada a uma taxa de mortalidade de 20 a 40% dentro de 1 a 6 meses. Embora se saiba que a microbiota intestinal pode promover doenças hepáticas induzidas por etanol, em ratinhos, os fatores microbianos responsáveis por este processo continuam por compreender. Daí o interesse nos resultados publicados na Nature sobre o papel da microbiota na transmissão e na progressão desta doença.

E. faecalis, secretores de citolisina

A investigação mostra que os doentes com hepatite alcoólica têm uma composição da microbiota fecal específica com, nomeadamente, 2700 vezes mais Enterococcus faecalis, bactérias encontradas nas fezes de 80% dos doentes. No entanto, certos tipos “citolíticos” destas bactérias produzem uma endotoxina chamada citolisina que se manifesta contra células eucarióticas e bactérias Gram-positivas. A presença de bactérias E. faecalis citolíticas parece estar relacionada com a gravidade da doença hepática e mortalidade dos doentes.

Da citolisina às lesões hepáticas

Ratinhos submetidos a uma dieta com um elevado teor de etanol (ou a uma dieta isocalórica de controlo, sem etanol) quer com estirpes citolíticas quer não citolíticas de E. faecalis, confirmaram que as estirpes citolíticas induziram mais lesões hepáticas, esteatose e inflamação e conduziram mais rapidamente à morte. Estas bactérias também foram encontradas nos fígados de todos os ratinhos submetidos ao regime com álcool, mas não nos fígados dos ratinhos de controlo, sugerindo que o etanol é necessário para a translocação do E. faecalis do intestino para o fígado.

Um bacteriófago protetor

Os investigadores estudaram posteriormente os efeitos terapêuticos dos bacteriófagos direcionados a E. faecalis citolíticos em ratinhos que receberam estirpes de E. faecalis responsáveis por esteatose hepática. Os bacteriófagos reduziram os níveis de citolisina no fígado dos roedores e eliminaram as lesões hepáticas induzidas pelo etanol. Os investigadores estudaram então ratinhos colonizados com bactérias de fezes provenientes de doentes com hepatite alcoólica. A administração de bacteriófagos suprimiu o aparecimento de lesões hepáticas e de esteatose e levou à diminuição da quantidade de Enterococcus.

Um tratamento no futuro?

Estes resultados não só estabeleceram uma ligação entre bactérias E. faecalis citolíticas e a gravidade e taxa de mortalidade da hepatite alcoólica, como também mostraram que um bacteriófago pode ter como alvo uma bactéria específica e, como tal, ser uma alternativa aos antibióticos. Ainda assim, é necessário que se desenvolvam estudos clínicos que provem a aplicabilidade da citolisina enquanto biomarcador em humanos e que confirmem que os bacteriófagos constituem uma abordagem terapêutica segura e eficaz.

Quando um vírus penetra no trato digestivo e está prestes a infetar as células intestinais, não está sozinho: milhares de milhões de bactérias da microbiota também lá se encontram e podem modular o seu potencia de infeção. Cientistas chegaram a esta conclusão acidentalmente enquanto trabalhavam em ratinhos Rag1-KO, um modelo de ratinhos imunodeficientes com infeção crónica por rotavírus (RV).

A microbiota como barreira contra o rotavírus

Estes investigadores observaram, de forma não intencional, o nascimento de uma linhagem de ratinhos resistentes ao RV, a que chamaram ratinhos GSU1. Depois, tentaram compreender a origem deste fenótipo resistente. Quando os ratinhos Rag1-KO recebiam as fezes de ratinhos GSU, tornavam-se resistentes ao RV, provando assim o papel da microbiota dos ratinhos GSU.

Uma bactéria filamentosa segmentada está envolvida

Uma série de tratamentos criteriosos (calor, filtrações, vários agentes antimicrobianos) complementados por uma análise do microbioma de ratinhos GSU indicou especificamente a presença de espécies de Candidatus arthromitus, uma bactéria filamentosa segmentada2 (BFS). Esta presença foi confirmada por microscopia eletrónica ao nível do íleo. In vitro, a estirpe da BFS tinha a mesma capacidade do que as fezes dos ratinhos GSU de reduzir a infeção por rotavírus das células epiteliais. In vivo, e isolada da microbiota, continuou a demonstrar, por si só, proteção contra o RV em ratinhos imunossuprimidos e germ-free, e a reduzir a incidência de diarreia em ratinhos recém-nascidos não-imunodeficientes, provando o seu próprio efeito protetor.

Um novo mecanismo não imunitário

Ao contrário da hipótese inicial dos investigadores, não está envolvido nenhum mecanismo imunitário conhecido na mediação da resistência ao RV (nem as IL-22/IL-17 nem o interferão λ). Várias vias não imunológicas podem coexistir: as BFS podem degradar a superfície do RV e evitar que este interaja com o epitélio. No entanto, o mecanismo subjacente parece estar localizado no lado do hospedeiro: a renovação das células epiteliais das vilosidades pode ser acelerada sob a influência das BFS, causando assim a expulsão das células potencialmente infetadas por RV. A microbiota pode então tornar-se um elemento chave para o desenvolvimento de novas estratégias contra infeções virais.

<sup>1. GSU significa Georgia State University, onde estes ratinhos nasceram.
2. Bactérias da família Clostridiales, que colonizam o intestino de várias espécies.</sup>

Como podemos ter como alvo bactérias patogénicas sem criar resistência ou induzir danos colaterais noutros membros da comunidade microbiana e com uma ferramenta simples mas eficaz? Uma equipa de Londres poderá ter encontrado a solução, baseada na CRISPR-Cas9, ou “tesoura moleculares” que pode implementar correções nos genes: um guia RNA reconhece uma sequência de ADN (chamada CRISPR) à qual a nuclease Cas9 se liga, cortando a sequência-alvo. E sabemos que qualquer corte no ADN circular bacteriano evita a sua replicação e induz a morte da célula.

Um vetor plasmídio

A ideia por trás deste estudo é a seguinte: em vez de inserir Cas9 no ADN bacteriano, os investigadores inseriram-na num plasmídio, um pequeno componente de ADN presente adicionalmente ao genoma bacteriano. Qual é a vantagem? As bactérias disseminam estes plasmídios através de um processo chamado conjugação*, até entre espécies diferentes. Até agora, porém, os estudos estavam limitados pela baixa frequência destas transferências de plasmídios. Esta deficiência foi colmatada através do desenvolvimento de um plasmídio que contém não apenas a nuclease Cas9, mas também algum equipamento necessário para o processo de conjugação. Graças às sucessivas conjugações entre bactérias (em que o recipiente se torna dador e assim sucessivamente), este novo plasmídio dissemina-se com muita rapidez, de uma população de E. coli (dadora) até uma população de quase 100 % de Salmonella entérica, considerando que quanto mais próximo for o contacto entre as células (num biofilme, por exemplo), maior a frequência da conjugação. Dever-se-á notar que esta propagação é possível porque a expressão da Cas9 é controlada: a arabinose é necessária para a expressão da nuclease e, portanto, para matar bactérias. Na ausência de arabinose, o plasmídio só é capaz de se disseminar.

Alvo: genes não essenciais

A eficácia do plasmídio em matar bactérias-alvo tinha ainda de ser avaliada ao variar um parâmetro: o gene cortado pela nuclease. Os investigadores testaram assim 65 fragmentos de guia RNA, cada um reconhecendo um gene diferente do ADN bacteriano de S. enterica – uns essenciais e outros não essenciais. Usando a E. coli como dador inicial do plasmídio, a equipa descobriu que a taxa de mortalidade da S. enterica variava entre 1 e 100 %, dependendo do gene-alvo. Embora estas diferenças estejam ainda por explicar, ter genes essenciais como alvo parece menos eficiente: leva à inserção de fragmentos de ADN no plasmídio, que subsequentemente perde a sua capacidade de matar bactérias. Ora isto não acontece com os genes não essencais.

Uma solução para alcançar os biofilmes?

Embora o modelo seja apenas baseado em 2 espécies testadas, teoricamente o plasmídio poderia ser transferido para uma comunidade microbiana complexa: portanto, a conjugação poderia já não ser o limite. Os investigadores têm agora de se centrar na eficácia do plasmídio e nos parâmetros que impactam a sua atividade. Este processo poderia ter uma vasta série de aplicações, incluindo a penetração de biofilmes que são difíceis de alcançar através de outros vetores: uma bactéria nativa do biofilme podia ser o dador inicial, permitindo assim que o plasmídio se disseminasse com muita rapidez e destruísse bactérias-alvo, mesmo as mais resistentes aos antibióticos.

^{*A bactéria dadora liga-se à recipiente e transfere uma hélice do ADN do plasmídio que mais tarde será novamente transformada pela recipiente num plasmídio de dupla hélice.}

A descoberta de ADN bacteriano no ambiente fetal colocou termo à crença de que este seria estéril. No entanto, a pergunta permanece: o ADN identificado vem de bactérias metabolicamente ativas e viáveis, de origem materna? Uma equipa americana deu a resposta, combinando estudos em humanos e ratinhos. Primeiro passo: caracterizaram as populações bacterianas dos pares mãe-bebé (5 bebés prematuros e 5 de termo) tendo por base amostras extraídas após cesariana, sob condições ótimas de esterilidade. A análise permitiu especificar a origem das bactérias encontradas na boca da criança e no mecónio, tendo por base as microbiotas vaginal, , retal, uterina, placentária e amniótica maternas. Como resultado, foi confirmada a existência de microbiota fetal, logo às 24 semanas de gestação. Esta provém do ambiente uterino e é maioritariamente composta por Escherichia e Acinetobacter.

Bactérias vivas no feto… a meio da gravidez

Segundo passo: em ratinhos, os investigadores visualizaram a flora intestinal de fetos e a sua viabilidade, assim como as alterações frequentes sofridas ao longo da gestação. Os seus dados sugeriram que a meio do período de gestação, o feto é exposto a bactérias viáveis e passíveis de cultura, de origem materna variável. Pelo contrário, no final do período de gestação, e apesar da presença de ADN com origem essencialmente na placenta e no líquido amniótico, as amostras acabaram por não ser passíveis de cultura. A hipótese sugerida foi a de que a maturação (tardia) do sistema imunitário levaria à eliminação progressiva dos microrganismos que fizessem a transposição até ao ambiente fetal.

Confirmada uma transmissão viável

A equipa validou as suas constatações sobre transmissão bacteriana durante a gestação através da colonização do intestino de ratinhas grávidas com E. coli marcada, antes de recuperarem estas bactérias viáveis nos seus descendentes. Todos os resultados consolidaram a existência de microbiota fetal de origem materna, que se altera durante a gestação e é provável que impacte no desenvolvimento do sistema imunitário e na constituição das microbiotas do recém-nascido, após o parto.

A microbiota vaginal é um ecossistema microbiano que se vai alterando e se encontra bem caracterizado. Está dividida em cinco grandes grupos baseados na sua composição: quatro são dominados por uma só espécie de Lactobacilus (L. crispatus, L. gasseri, L. iners or L. jensenii) e o quinto é heterogéneo, constituído por um elevado número de estirpes anaeróbias, como Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae e Prevotella spp. Este último é indicador de vaginose bacteriana e está associado ao aumento do risco de infertilidade e de infeções sexualmente transmissíveis.

Tendo em conta o impacto da microbiota vaginal na saúde íntima da mulher e as suas consequências para a reprodução, uma equipa americana focou-se na relação entre o perfil bacteriano e a colonização pela levedura Candida. A Candida é uma levedura comensal da microbiota vaginal, mas é responsável pela candidíase vulvovaginal, caracterizada por uma resposta agressiva do hospedeiro à proliferação excessiva de fungos oportunistas. Foram feitos esfregaços vaginais a 255 mulheres com idades entre os 14 e 15 anos, de ascendência caucasiana (53%) ou africana (47%), que foram usados para identificar lactobacilos dominantes e para avaliar e quantificar a colonização por Candida.

Variações étnicas da microbiota…

Resultados dos testes: 16% das mulheres tinham candidíase (90% por C. albicans e cerca de 10% por C. glabrata), com a percentagem mais elevada em microbiotas com predominância de L. iners versus L. crispatus (39% e 20%, respetivamente). Esta diferença reflete-se a nível étnico, já que o grupo com predominância de L. iners é mais frequentemente associado a mulheres com descendência africana do que a mulheres com origem caucasiana (46,7% vs. 31,9%). As conclusões deste estudo confirmam os dados da literatura.

...e regulação do ácido láctico

Os investigadores acreditam que a correlação entre as espécies de lactobacilos e o risco de desenvolvimento de candidíase é baseada na capacidade menor ou maior de cada espécie em acidificar o ambiente vaginal. Testes in vitro demonstraram que o L. crispatus produz vastas quantidades de ácido láctico, levando ao decréscimo do pH local (perto de 4,0) versus um pH de 4,6 com L. iners, o que é suficiente para inibir o crescimento de C. albicans.

Diferenciar comunidades bacterianas vaginais pode então ajudar-nos a identificar a predisposição para candidíase. Este é o primeiro passo no sentido de desenvolvermos estratégias feitas à medida, preventivas e curativas, baseadas na modulação da microbiota.

Vários estudos documentaram o papel fulcral da microbiota intestinal na imunidade, ainda que a evidência clínica permaneça limitada. Um melhor entendimento dos mecanismos subjacentes é crucial em termos de saúde pública, em especial para desenvolver terapêuticas que visem a microbiota em casos de distúrbios imunitários. Neste contexto e com base na observação de que a eficácia da vacina varia tanto quanto a microbiota intestinal de indivíduos em diferentes partes do mundo, os investigadores centraram-se no impacto dos antibióticos sobre a resposta imunitária à vacinação

O efeito dos antibióticos na vacinação

Para este fim, os cientistas estudaram duas populações com diferentes níveis de anticorpos antigripe na linha basal. Na primeira população, 22 adultos saudáveis foram vacinados contra a influenza sazonal (vacina que contém 3 estirpes de vírus atenuados), e 3 dias antes da vacinação, metade deles iniciaram tratamento com antibiótico durante 5 dias. Tal como esperado, os antibióticos produziram um impacto profundo e durável na composição da microbiota intestinal. Porém, contrariamente à hipótese dos investigadores, a produção de anticorpos em resposta à vacinação não foi afetada pelo uso de antibióticos. Tal efeito foi apenas observado na segunda coorte, composta por 11 indivíduos sem imunidade preexistente contra a influenza (sem gripe ou vacinação* recentes): os antibióticos produziram um decréscimo na produção de anticorpos IgG1 e IgA contra a estirpe viral H1N1. Os antibióticos de largo espetro podem assim, em alguns casos, perturbar a resposta imune à vacinação.

Ácidos biliares: mensageiros da inflamação

Os investigadores também observaram que as alterações induzidas pela vacinação ao nível dos metabolitos sanguíneos eram diferentes no grupo de recebeu antibióticos e no grupo de controlo, especialmente no que respeita a substâncias derivadas do metabolismo dos ácidos biliares. Dever-se-á recordar que a microbiota transforma ácidos biliares primários – segregados pela vesícula biliar e fornecidos aos intestinos – em ácidos biliares secundários. Estes são depois parcialmente reabsorvidos. Porém, nos indivíduos que receberam antibioterapia, observou-se um aumento dos ácidos biliares primários no sangue e um importante decréscimo dos ácidos biliares secundários. A antibioterapia poderia até reduzir 1000 vezes o mais importante de todos, ou seja, o ácido litocólico. Este decréscimo em ácidos biliares secundários foi fortemente correlacionado com o aumento de moléculas pró-inflamatórias. Isto sugere que uma alteração na proporção de ácidos biliares induzida pela antibioterapia poderá ser um dos mecanismos que regula a resposta inflamatória.

Duas vias diferentes de resposta

Haverá uma ligação entre a via que modula a produção de anticorpos e aquela que envolve os ácidos biliares e a inflamação? De acordo com os investigadores, não existe tal ligação: mapearam todas as diferentes vias de sinalização, desde a destruição da microbiota após a administração de antibióticos até às alterações nos metabolitos sanguíneos, e concluíram que as duas vias são independentes. Concluindo, a profunda destruição da microbota induzida pelo uso de antibióticos poderá modular a função imunitária através de dois mecanismos distintos: ao interagir diretamente com as células imunitárias, ou de uma forma sistémica, ao modular da produção de alguns metabolitos fundamentais.

^{*sem vacinação recente ou gripe, conforme comprovado pelos baixos níveis de anticorpos (1.ª coorte: níveis séricos < 320 para pelo menos 2 das 3 estirpes incluídas na vacina; 2.ª coorte: níveis séricos ≤ 320 para as 3 estirpes contidas na vacina).}

A microbiota intestinal esconde informações muito preciosas, tais como doenças, inflamação, uso de antibióticos, forma de alimentação. Mas será que também reflete a nossa idade? Uma equipa de investigadores ingleses procurou uma resposta analisando a composição da microbiota intestinal de 1.165 pessoas saudáveis. Os cientistas obtiveram uma lista de 39 espécies bacterianas que permitiram classificar cada amostra em três categorias de idade, com uma precisão de 3,94 anos. Esse nível de precisão excede o dos modelos desenvolvidos até agora, porque não é a primeira vez que alguém investiga o “relógio de envelhecimento microbiótico".

Nem envelhecimento, nem rejuvenescimento

Pode isto significar que algumas bactérias são rejuvenescedoras enquanto outras estão associadas a um envelhecimento precoce? A conclusão não é automática: as bactérias patogénicas não parecem estar necessariamente correlacionadas com o envelhecimento e a abundância de bactérias consideradas benéficas para a nossa saúde parece prolongar a juventude. Por exemplo, são encontradas na microbiota intestinal de indivíduos mais jovens maiores quantidades de Campylobacter jejuni, uma bactéria que causa diarreia. Contudo, o mesmo já não acontece em idosos, levando a crer que possam ter adquirido imunidade protetora ao longo do tempo.

Diferença geracional significativa

Outro fator-chave a considerar são as principais mudanças nos modos de vida (dieta, estilo de vida sedentário, fatores ambientais ...) no último século. Nesse contexto, é difícil dizer se a composição da flora dos jovens de hoje sofrerá as mesmas mudanças do que nos mais velhos. Por outras palavras, está em causa o próprio princípio do relógio do envelhecimento microbiótico. Os investigadores que também são os fundadores de uma empresa de biotecnologia especializada no tratamento de doenças relacionadas com o envelhecimento e o prolongamento da vida humana, reconhecem esse viés. Um “elixir da juventude” bacteriano ainda não está ao alcance de nossa flora - ou das prateleiras dos supermercados, pelo menos por enquanto.

Sabemos hoje que uma menor diversidade de microrganismos na microbiota intestinal está associada a doenças como a diabetes mellitus, cancro colorretal e a patologias gastrointestinais complexas como doenças crónicas inflamatórias do intestino (DCII). No entanto, de forma a podermos usar a diversidade como biomarcador, é necessário ver devidamente este quadro: os metabolitos fecais indicam a composição da microbiota, mas e os sanguíneos?

Foram identificados 40 metabolitos preditivos

Para o descobrir, uma equipa tentou prever a diversidade da microbiota intestinal baseando-se em 1000 análises sanguíneas de uma cohort composta por 399 adultos americanos saudáveis inscritos em programas de bem-estar. Os resultados mostraram que 40 metabolitos encontrados no sangue dos hospedeiros, dos quais 13 eram de origem microbiana, explicavam 45% da diversidade da microbiota intestinal, e poderiam assim prevê-la. A capacidade preditiva dos metabolitos foi confirmada numa outra cohort de validação que incluiu 540 pessoas mais ou menos saudáveis.

Nem em demasiada, nem pouca diversidade

Além disso, os resultados sugerem que, em vez de diversidade máxima, uma diversidade ótima deve ser priorizada para que nos mantenhamos saudáveis. Por outro lado, foram observadas uma associação entre metabolitos microbianos com polifenóis e a diversidade da microbiota intestinal, o que pode ser o reflexo de uma dieta com alto teor de frutas, vegetais e cereais (muito concentrados em polifenóis); alguns metabolitos que podem prever a diversidade estão relacionados com doenças cardiovasculares ou renais. Como tal, não só a falta de diversidade, mas também o seu excesso, podem ser prejudiciais, ao ponto de os autores mencionarem a ideia de um valor ideal, caracterizado por “nem muita nem demasiado pouca” diversidade, dependendo do índice de massa corporal (IMC). Por fim, este estudo destacou que a associação entre os metabolitos sanguíneos e a diversidade da microbiota intestinal não era igual ao longo do continuum de IMC, o que sugere que limitar a análise às categorias “normal” e “obeso” é demasiado restritivo.

Rumo a testes clínicos?

Como um todo, estes resultados comprovam a relação de proximidade existente entre a fisiologia do hospedeiro e a microbiota intestinal e sugerem que o metabolismo sanguíneo do hospedeiro é uma importante interface entre o ecossistema intestinal e a saúde humana. Eventualmente, a capacidade preditiva dos marcadores plasmáticos em relação à diversidade da microbiota intestinal pode abrir o caminho ao desenvolvimento de testes clínicos de monitorização da saúde da microbiota intestinal, através de uma simples amostra sanguínea, fácil de manusear.