Como podemos ter como alvo bactérias patogénicas sem criar resistência ou induzir danos colaterais noutros membros da comunidade microbiana e com uma ferramenta simples mas eficaz? Uma equipa de Londres poderá ter encontrado a solução, baseada na CRISPR-Cas9, ou “tesoura moleculares” que pode implementar correções nos genes: um guia RNA reconhece uma sequência de ADN (chamada CRISPR) à qual a nuclease Cas9 se liga, cortando a sequência-alvo. E sabemos que qualquer corte no ADN circular bacteriano evita a sua replicação e induz a morte da célula.

Um vetor plasmídio

A ideia por trás deste estudo é a seguinte: em vez de inserir Cas9 no ADN bacteriano, os investigadores inseriram-na num plasmídio, um pequeno componente de ADN presente adicionalmente ao genoma bacteriano. Qual é a vantagem? As bactérias disseminam estes plasmídios através de um processo chamado conjugação*, até entre espécies diferentes. Até agora, porém, os estudos estavam limitados pela baixa frequência destas transferências de plasmídios. Esta deficiência foi colmatada através do desenvolvimento de um plasmídio que contém não apenas a nuclease Cas9, mas também algum equipamento necessário para o processo de conjugação. Graças às sucessivas conjugações entre bactérias (em que o recipiente se torna dador e assim sucessivamente), este novo plasmídio dissemina-se com muita rapidez, de uma população de E. coli (dadora) até uma população de quase 100 % de Salmonella entérica, considerando que quanto mais próximo for o contacto entre as células (num biofilme, por exemplo), maior a frequência da conjugação. Dever-se-á notar que esta propagação é possível porque a expressão da Cas9 é controlada: a arabinose é necessária para a expressão da nuclease e, portanto, para matar bactérias. Na ausência de arabinose, o plasmídio só é capaz de se disseminar.

Alvo: genes não essenciais

A eficácia do plasmídio em matar bactérias-alvo tinha ainda de ser avaliada ao variar um parâmetro: o gene cortado pela nuclease. Os investigadores testaram assim 65 fragmentos de guia RNA, cada um reconhecendo um gene diferente do ADN bacteriano de S. enterica – uns essenciais e outros não essenciais. Usando a E. coli como dador inicial do plasmídio, a equipa descobriu que a taxa de mortalidade da S. enterica variava entre 1 e 100 %, dependendo do gene-alvo. Embora estas diferenças estejam ainda por explicar, ter genes essenciais como alvo parece menos eficiente: leva à inserção de fragmentos de ADN no plasmídio, que subsequentemente perde a sua capacidade de matar bactérias. Ora isto não acontece com os genes não essencais.

Uma solução para alcançar os biofilmes?

Embora o modelo seja apenas baseado em 2 espécies testadas, teoricamente o plasmídio poderia ser transferido para uma comunidade microbiana complexa: portanto, a conjugação poderia já não ser o limite. Os investigadores têm agora de se centrar na eficácia do plasmídio e nos parâmetros que impactam a sua atividade. Este processo poderia ter uma vasta série de aplicações, incluindo a penetração de biofilmes que são difíceis de alcançar através de outros vetores: uma bactéria nativa do biofilme podia ser o dador inicial, permitindo assim que o plasmídio se disseminasse com muita rapidez e destruísse bactérias-alvo, mesmo as mais resistentes aos antibióticos.

^{*A bactéria dadora liga-se à recipiente e transfere uma hélice do ADN do plasmídio que mais tarde será novamente transformada pela recipiente num plasmídio de dupla hélice.}

A descoberta de ADN bacteriano no ambiente fetal colocou termo à crença de que este seria estéril. No entanto, a pergunta permanece: o ADN identificado vem de bactérias metabolicamente ativas e viáveis, de origem materna? Uma equipa americana deu a resposta, combinando estudos em humanos e ratinhos. Primeiro passo: caracterizaram as populações bacterianas dos pares mãe-bebé (5 bebés prematuros e 5 de termo) tendo por base amostras extraídas após cesariana, sob condições ótimas de esterilidade. A análise permitiu especificar a origem das bactérias encontradas na boca da criança e no mecónio, tendo por base as microbiotas vaginal, , retal, uterina, placentária e amniótica maternas. Como resultado, foi confirmada a existência de microbiota fetal, logo às 24 semanas de gestação. Esta provém do ambiente uterino e é maioritariamente composta por Escherichia e Acinetobacter.

Bactérias vivas no feto… a meio da gravidez

Segundo passo: em ratinhos, os investigadores visualizaram a flora intestinal de fetos e a sua viabilidade, assim como as alterações frequentes sofridas ao longo da gestação. Os seus dados sugeriram que a meio do período de gestação, o feto é exposto a bactérias viáveis e passíveis de cultura, de origem materna variável. Pelo contrário, no final do período de gestação, e apesar da presença de ADN com origem essencialmente na placenta e no líquido amniótico, as amostras acabaram por não ser passíveis de cultura. A hipótese sugerida foi a de que a maturação (tardia) do sistema imunitário levaria à eliminação progressiva dos microrganismos que fizessem a transposição até ao ambiente fetal.

Confirmada uma transmissão viável

A equipa validou as suas constatações sobre transmissão bacteriana durante a gestação através da colonização do intestino de ratinhas grávidas com E. coli marcada, antes de recuperarem estas bactérias viáveis nos seus descendentes. Todos os resultados consolidaram a existência de microbiota fetal de origem materna, que se altera durante a gestação e é provável que impacte no desenvolvimento do sistema imunitário e na constituição das microbiotas do recém-nascido, após o parto.

A microbiota vaginal é um ecossistema microbiano que se vai alterando e se encontra bem caracterizado. Está dividida em cinco grandes grupos baseados na sua composição: quatro são dominados por uma só espécie de Lactobacilus (L. crispatus, L. gasseri, L. iners or L. jensenii) e o quinto é heterogéneo, constituído por um elevado número de estirpes anaeróbias, como Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae e Prevotella spp. Este último é indicador de vaginose bacteriana e está associado ao aumento do risco de infertilidade e de infeções sexualmente transmissíveis.

Tendo em conta o impacto da microbiota vaginal na saúde íntima da mulher e as suas consequências para a reprodução, uma equipa americana focou-se na relação entre o perfil bacteriano e a colonização pela levedura Candida. A Candida é uma levedura comensal da microbiota vaginal, mas é responsável pela candidíase vulvovaginal, caracterizada por uma resposta agressiva do hospedeiro à proliferação excessiva de fungos oportunistas. Foram feitos esfregaços vaginais a 255 mulheres com idades entre os 14 e 15 anos, de ascendência caucasiana (53%) ou africana (47%), que foram usados para identificar lactobacilos dominantes e para avaliar e quantificar a colonização por Candida.

Variações étnicas da microbiota…

Resultados dos testes: 16% das mulheres tinham candidíase (90% por C. albicans e cerca de 10% por C. glabrata), com a percentagem mais elevada em microbiotas com predominância de L. iners versus L. crispatus (39% e 20%, respetivamente). Esta diferença reflete-se a nível étnico, já que o grupo com predominância de L. iners é mais frequentemente associado a mulheres com descendência africana do que a mulheres com origem caucasiana (46,7% vs. 31,9%). As conclusões deste estudo confirmam os dados da literatura.

...e regulação do ácido láctico

Os investigadores acreditam que a correlação entre as espécies de lactobacilos e o risco de desenvolvimento de candidíase é baseada na capacidade menor ou maior de cada espécie em acidificar o ambiente vaginal. Testes in vitro demonstraram que o L. crispatus produz vastas quantidades de ácido láctico, levando ao decréscimo do pH local (perto de 4,0) versus um pH de 4,6 com L. iners, o que é suficiente para inibir o crescimento de C. albicans.

Diferenciar comunidades bacterianas vaginais pode então ajudar-nos a identificar a predisposição para candidíase. Este é o primeiro passo no sentido de desenvolvermos estratégias feitas à medida, preventivas e curativas, baseadas na modulação da microbiota.

Vários estudos documentaram o papel fulcral da microbiota intestinal na imunidade, ainda que a evidência clínica permaneça limitada. Um melhor entendimento dos mecanismos subjacentes é crucial em termos de saúde pública, em especial para desenvolver terapêuticas que visem a microbiota em casos de distúrbios imunitários. Neste contexto e com base na observação de que a eficácia da vacina varia tanto quanto a microbiota intestinal de indivíduos em diferentes partes do mundo, os investigadores centraram-se no impacto dos antibióticos sobre a resposta imunitária à vacinação

O efeito dos antibióticos na vacinação

Para este fim, os cientistas estudaram duas populações com diferentes níveis de anticorpos antigripe na linha basal. Na primeira população, 22 adultos saudáveis foram vacinados contra a influenza sazonal (vacina que contém 3 estirpes de vírus atenuados), e 3 dias antes da vacinação, metade deles iniciaram tratamento com antibiótico durante 5 dias. Tal como esperado, os antibióticos produziram um impacto profundo e durável na composição da microbiota intestinal. Porém, contrariamente à hipótese dos investigadores, a produção de anticorpos em resposta à vacinação não foi afetada pelo uso de antibióticos. Tal efeito foi apenas observado na segunda coorte, composta por 11 indivíduos sem imunidade preexistente contra a influenza (sem gripe ou vacinação* recentes): os antibióticos produziram um decréscimo na produção de anticorpos IgG1 e IgA contra a estirpe viral H1N1. Os antibióticos de largo espetro podem assim, em alguns casos, perturbar a resposta imune à vacinação.

Ácidos biliares: mensageiros da inflamação

Os investigadores também observaram que as alterações induzidas pela vacinação ao nível dos metabolitos sanguíneos eram diferentes no grupo de recebeu antibióticos e no grupo de controlo, especialmente no que respeita a substâncias derivadas do metabolismo dos ácidos biliares. Dever-se-á recordar que a microbiota transforma ácidos biliares primários – segregados pela vesícula biliar e fornecidos aos intestinos – em ácidos biliares secundários. Estes são depois parcialmente reabsorvidos. Porém, nos indivíduos que receberam antibioterapia, observou-se um aumento dos ácidos biliares primários no sangue e um importante decréscimo dos ácidos biliares secundários. A antibioterapia poderia até reduzir 1000 vezes o mais importante de todos, ou seja, o ácido litocólico. Este decréscimo em ácidos biliares secundários foi fortemente correlacionado com o aumento de moléculas pró-inflamatórias. Isto sugere que uma alteração na proporção de ácidos biliares induzida pela antibioterapia poderá ser um dos mecanismos que regula a resposta inflamatória.

Duas vias diferentes de resposta

Haverá uma ligação entre a via que modula a produção de anticorpos e aquela que envolve os ácidos biliares e a inflamação? De acordo com os investigadores, não existe tal ligação: mapearam todas as diferentes vias de sinalização, desde a destruição da microbiota após a administração de antibióticos até às alterações nos metabolitos sanguíneos, e concluíram que as duas vias são independentes. Concluindo, a profunda destruição da microbota induzida pelo uso de antibióticos poderá modular a função imunitária através de dois mecanismos distintos: ao interagir diretamente com as células imunitárias, ou de uma forma sistémica, ao modular da produção de alguns metabolitos fundamentais.

^{*sem vacinação recente ou gripe, conforme comprovado pelos baixos níveis de anticorpos (1.ª coorte: níveis séricos < 320 para pelo menos 2 das 3 estirpes incluídas na vacina; 2.ª coorte: níveis séricos ≤ 320 para as 3 estirpes contidas na vacina).}

A microbiota intestinal esconde informações muito preciosas, tais como doenças, inflamação, uso de antibióticos, forma de alimentação. Mas será que também reflete a nossa idade? Uma equipa de investigadores ingleses procurou uma resposta analisando a composição da microbiota intestinal de 1.165 pessoas saudáveis. Os cientistas obtiveram uma lista de 39 espécies bacterianas que permitiram classificar cada amostra em três categorias de idade, com uma precisão de 3,94 anos. Esse nível de precisão excede o dos modelos desenvolvidos até agora, porque não é a primeira vez que alguém investiga o “relógio de envelhecimento microbiótico".

Nem envelhecimento, nem rejuvenescimento

Pode isto significar que algumas bactérias são rejuvenescedoras enquanto outras estão associadas a um envelhecimento precoce? A conclusão não é automática: as bactérias patogénicas não parecem estar necessariamente correlacionadas com o envelhecimento e a abundância de bactérias consideradas benéficas para a nossa saúde parece prolongar a juventude. Por exemplo, são encontradas na microbiota intestinal de indivíduos mais jovens maiores quantidades de Campylobacter jejuni, uma bactéria que causa diarreia. Contudo, o mesmo já não acontece em idosos, levando a crer que possam ter adquirido imunidade protetora ao longo do tempo.

Diferença geracional significativa

Outro fator-chave a considerar são as principais mudanças nos modos de vida (dieta, estilo de vida sedentário, fatores ambientais ...) no último século. Nesse contexto, é difícil dizer se a composição da flora dos jovens de hoje sofrerá as mesmas mudanças do que nos mais velhos. Por outras palavras, está em causa o próprio princípio do relógio do envelhecimento microbiótico. Os investigadores que também são os fundadores de uma empresa de biotecnologia especializada no tratamento de doenças relacionadas com o envelhecimento e o prolongamento da vida humana, reconhecem esse viés. Um “elixir da juventude” bacteriano ainda não está ao alcance de nossa flora - ou das prateleiras dos supermercados, pelo menos por enquanto.

Sabemos hoje que uma menor diversidade de microrganismos na microbiota intestinal está associada a doenças como a diabetes mellitus, cancro colorretal e a patologias gastrointestinais complexas como doenças crónicas inflamatórias do intestino (DCII). No entanto, de forma a podermos usar a diversidade como biomarcador, é necessário ver devidamente este quadro: os metabolitos fecais indicam a composição da microbiota, mas e os sanguíneos?

Foram identificados 40 metabolitos preditivos

Para o descobrir, uma equipa tentou prever a diversidade da microbiota intestinal baseando-se em 1000 análises sanguíneas de uma cohort composta por 399 adultos americanos saudáveis inscritos em programas de bem-estar. Os resultados mostraram que 40 metabolitos encontrados no sangue dos hospedeiros, dos quais 13 eram de origem microbiana, explicavam 45% da diversidade da microbiota intestinal, e poderiam assim prevê-la. A capacidade preditiva dos metabolitos foi confirmada numa outra cohort de validação que incluiu 540 pessoas mais ou menos saudáveis.

Nem em demasiada, nem pouca diversidade

Além disso, os resultados sugerem que, em vez de diversidade máxima, uma diversidade ótima deve ser priorizada para que nos mantenhamos saudáveis. Por outro lado, foram observadas uma associação entre metabolitos microbianos com polifenóis e a diversidade da microbiota intestinal, o que pode ser o reflexo de uma dieta com alto teor de frutas, vegetais e cereais (muito concentrados em polifenóis); alguns metabolitos que podem prever a diversidade estão relacionados com doenças cardiovasculares ou renais. Como tal, não só a falta de diversidade, mas também o seu excesso, podem ser prejudiciais, ao ponto de os autores mencionarem a ideia de um valor ideal, caracterizado por “nem muita nem demasiado pouca” diversidade, dependendo do índice de massa corporal (IMC). Por fim, este estudo destacou que a associação entre os metabolitos sanguíneos e a diversidade da microbiota intestinal não era igual ao longo do continuum de IMC, o que sugere que limitar a análise às categorias “normal” e “obeso” é demasiado restritivo.

Rumo a testes clínicos?

Como um todo, estes resultados comprovam a relação de proximidade existente entre a fisiologia do hospedeiro e a microbiota intestinal e sugerem que o metabolismo sanguíneo do hospedeiro é uma importante interface entre o ecossistema intestinal e a saúde humana. Eventualmente, a capacidade preditiva dos marcadores plasmáticos em relação à diversidade da microbiota intestinal pode abrir o caminho ao desenvolvimento de testes clínicos de monitorização da saúde da microbiota intestinal, através de uma simples amostra sanguínea, fácil de manusear.

A terapia imunológica com inibidores de checkpoint (TIIC) é uma forma de imunoterapia que constitui uma nova opção terapêutica contra alguns tipos de tumores, tais como o melanoma e o cancro do pulmão de não pequenas células (CPNPC). Apesar da sua eficácia, apenas um número restrito de doentes pode beneficiar dela. É por isso importante antecipar de forma mais eficaz a resposta ao tratamento e melhorar as guidelines de prescrições de rotina. Com essa finalidade, uma equipa de investigadores indagou se a duração da administração de antibióticos de largo espetro (ABL) maioritariamente usados para tratar infeções respiratórias - antes ou de forma concomitante com a TIIC – pode ter um impacto na eficácia do tratamento, devido à sua modulação da microbiota intestinal.

A sobrevivência dos doentes desceu dos 26 para os 2 meses

Este estudo de cohort prospetivo, conduzido em dois hospitais universitários, incluiu 196 doentes (137 homens e 59 mulheres, idade média: 68 anos) com cancro (119 com CPNPC, 38 com melanoma e 39 com outros tipos de cancro) que receberam TIIC durante mais de três anos. Os resultados indicam que a terapêutica com antibióticos administrada nos 30 dias antes da TIIC (pAB, isto é, antibióticos prévios) fez decrescer claramente a sobrevivência global dos doentes, independentemente do tipo de cancro (2 meses para doentes que receberam pABL vs. 26 meses para aqueles que não fizeram nenhum tratamento prévio com antibióticos). A percentagem de tumores refratários à terapêutica também foi consideravelmente mais alta em doentes que fizeram pABL (81% vs. 44%). Em conclusão, a altura da administração de antibióticos é crucial: embora não tenha um impacto negativo quando feita de forma concomitante com a TIIC, piora o prognóstico quando administrada previamente.

Compreender o papel da microbiota intestinal

Os autores sabem que os seus resultados são limitados pelo tamanho reduzido da cohort utilizada e pela falta da análise de correlação entre a terapêutica antibiótica e a composição da microbiota dos doentes. No entanto, estão alinhados com os resultados de estudos anteriores, que indicam que a disbiose intestinal está associada a uma fraca resposta à TIIC no cancro. Uma explicação possível é a de que a utilização de antibióticos pode levar a perturbações duradouras no ecossistema intestinal, o que pode prejudicar a eficácia das células T no combate ao cancro. No entanto, esta hipótese é pouco precisa e devem ser desenvolvidos estudos mecanicistas assim que possível para compreender como as alterações da microbiota intestinal induzidas pelo uso prévio de antibióticos impactam negativamente a eficácia da TIIC.

Como o impacto da microbiota intestinal na nossa saúde está cada vez mais documentado, estão a ser desenvolvidas estratégias capazes de modificar a microbiota de forma favorável, nomeadamente através da dieta. Alguns investigadores focaram-se então em alimentos específicos, destinados a atuar sobre a microbiota ou ADM (alimentos direcionados à microbiota); neste caso, em polissacarídeos (fibras das plantas).

Analisaram-se 34

Um modelo murino conduziu a um melhor entendimento de como as nossas bactérias intestinais humanas interagem com os polissacarídeos da dieta, tal como umas com as outras: ratinhos germ-free colonizados por estirpes bacterianas intestinais benéficas (Bacteroides spp. de um adulto macho magro, o que o distinguia do seu gémeo obeso) foram alimentados com combinações diferentes de 34 fibras alimentares, em adição a uma dieta pobre em fibras (representativa da típica dieta americana). Através da combinação de várias tecnologias de ponta, os investigadores identificaram os compostos bioativos das fibras que promoviam o desenvolvimento de espécies Bacteroides. Vinte e um dos 34 polissacarídeos testados melhoraram significativamente o crescimento de algumas espécies, tais como a pectina dos citrinos e a fibra da ervilha com Bacteroides thetaiotaomicron. Estes resultados podem eventualmente levar-nos a aumentar o teor destes compostos ativos na nossa dieta.

Competição inter espécies

Para compreender os mecanismos envolvidos e identificar as fibras que são ingeridas ou não, foram feitas experiências adicionais usando biossensores i.e., esferas magnéticas revestidas com polissacarídeos e facilmente removíveis das fezes. Confirmaram que 2 espécies bacterianas diferentes (por exemplo Bacteroides cellulosilyticus e Bacteroides vulgatus) são capazes de degradar os mesmos polissacarídeos, desde que tenham os genes necessários. Como resultado, concluíram que estirpes diferentes competem por recursos nutricionais.

Rumo à medicina nutricional personalizada?

Analisando como os microrganismos do intestino se adaptam ao seu ambiente (contrabalançando a ausência de uma espécie específica ou competindo uns com os outros), os cientistas observaram que algumas bactérias eram mais flexíveis do que outras quanto ao substrato utilizado. É o caso dos Bacteroides ovatus, capazes de se adaptarem à presença de B. cellulosilyticus, seus competidores para arabinoxilanos (componentes maioritários das paredes celulares de cereais e ervilhas), enquanto os B. vulgatus não têm essa capacidade. Identificar que organismos são os mais flexíveis ajuda-nos a compreender como certas estirpes podem coexistir com outros “habitantes” da comunidade intestinal. Com base nestes resultados, a equipa prevê o desenvolvimento de guidelines alimentares personalizadas, baseadas em dados microbiológicos e fisiológicos do hospedeiro, obtidos através de biossensores.

Como podemos lutar contra a transmissão de patógenos altamente resistentes a antibióticos, como o Enterococcus faecium resistente à vancomicina (ERV), nos estabelecimentos de saúde? Surgiu uma abordagem promissora, baseada no reforço da resistência intestinal à colonização através da administração de bactérias intestinais protetoras. Em ratinhos, o transplante bacteriano parece restabelecer a resistência à colonização e reduzir a densidade intestinal de ERV. Isto foi conseguido através da uma combinação denominada “CBBPSCSK” de 4 estirpes bacterianas, incluindo Blautia producta (BPSCSK; em que SCSK designa a estirpe Blautia). Contudo, o mecanismo subjacente envolvido ainda teria de ser desvendado. Isso foi parcialmente conseguido em trabalhos de cientistas americanos, publicados recentemente na Nature.

Um lantibiótico simular ao corante E234

Tendo em conta resultados experimentais, o BPSCSK pode ajudar a reduzir o crescimento de ERV pela secreção de um lantibiótico semelhante à nisina, produzido pelo Lactococcus lactis e amplamente usado na indústria alimentar como conservante (E234). Semelhante, mas… muito mais eficaz e seletivo.

Mais eficaz e seletivo in vivo

Embora o crescimento do ERV seja inibido tanto pelo BPSCSK como pelo L. lactis in vitro, in vivo é muito diferente: apenas o BPSCSK é detetado no cólon (onde representa cerca de 25% das bactérias presentes, 5 dias após a administração de CBBPSCSK); reduz a quantidade de ERV e inibe patógenos Gram+ enquanto preserva outras bactérias intestinais comensais. Pelo contrário, o L. lactis não é capaz de colonizar o trato gastrointestinal e tem um espetro de ação mais alargado, à custa de algumas bactérias benéficas.

Um potencial agente probiótico

Os resultados também enfatizam que os genes que codificam a síntese de lantibióticos estão presentes naturalmente nos microbiomas humanos de indivíduos saudáveis; e que as espécies produtoras de lantibióticos inibem o ERV. Adicionalmente, em 22 doentes com risco elevado de infeção por ERV (já que iriam fazer um transplante de células hematopoiéticas), uma maior abundância de genes codificadores de lantibióticos foi associada a uma menor quantidade de E. faecium. Do mesmo modo, em ratinhos germ-free transplantados com preparações fecais destes doentes, correlacionou-se a resistência à colonização por ERV com a abundância de genes lantibióticos. Isto suporta a ideia de que as bactérias intestinais produtoras de lantibióticos reduzem a colonização por ERV e são potenciais agentes probióticos que podem restabelecer a resistência contra este patógeno.

^{*péptido bacteriano de baixo peso molecular com atividade antimicrobiana, produzido por um grande número de bactérias Gram-positivas.}